肝脏，组织，肉样处理方法

河南百奥生物工程有限公司盐酸克伦特罗（瘦肉精）快速检测试纸条 组织、肉样、肝脏样品的处理程序

•  检测组织、肉样、肝脏等样品所需仪器设备及试剂（本产品包装盒中不提供）

•  所需设备

1 、微孔板酶标仪（ 450nm ）

2 、振荡器

3 、离心机

4 、 20ul 、 50ul 、 100ul 、 200ul 微量加样器

5 、 RIDA C18 柱（ Art.No.:R2002 ）

  ( 二 ) 所需试剂

  1 、甲醇

  2 、氢氧化钠

  3 、庚烷（ n- heptane ）

  4 、 50mM HCL     

  5 、 50mM 磷酸二氢钾缓冲液 PH3.0

  6 、 500mM 磷酸二氢钾缓冲液 PH3.0

  7 、 50mM Tris   缓冲液 pH8.5

 

二、带有低脂肪的肝、肉或组织的样品处理方法

•  5g 粉碎的样品与 25ml 50mM HCL 混合，振荡 1.5 小时，以达到均质的目的。

•  称 6g 均质物（相当于 1g 肝脏），加入离心瓶中，

•  离心 15 分钟 /4000g 或更高的转速，在 10 — 15 ℃（非常重要），

•  转移上清液到另一个离心瓶中，加 300ul 1M NaOH 混合 15 分钟，

•  加入 4ml 500mM 磷酸二氢钾缓冲液 pH3.0 ，简单的混合并在 4 ℃保存至少 1.5 小时或过夜（非常重要）。

•  离心 15 分钟 /4000g 或更高的转速，在 10 — 15 ℃（非常重要），分离全部上清液（应该是清亮的，非常重要），使其升至室温（ 20-24 ℃），然后用 RIDA C18 柱纯化（见 RIDA C18 柱纯化步骤）。

•  肉和组织的处理方法

1 、 5g 粉碎的样品与 25ml   50mM Tris 缓冲液 pH8.5 混合，振荡 0.5 小时，以达到均质的目的；

2 、加入 15ml 庚烷（ n- heptane ）振荡 5 分钟以除去脂肪；

3 、离心 5 分钟 / 400g 或更高的速度 /1 0 ～ 15 度；

4 、用巴德吸管除去上面的庚烷层及中间薄薄的脂肪；

5 、再用 15ml 庚烷 （ n- heptane ）重复步骤 2 ～ 4 ；

6 、向均质的肉液中加入 0.5ml 半浓的盐酸，振荡 1 小时；

7 、称 6g 均质物（相当于 1g 肝脏），加入离心瓶中；

8 、离心 15 分钟 / 400g 或更高的转速，在 10 ～ 15 ℃ （非常重要）；

9 、转移上清液到另一个离心瓶中，加 300ul 1M NaOH 混合 15 分钟；

10 、加入 4ml 500m M 磷酸二氢钾缓冲液 pH3.0 ，简单的混合并在 4 ℃ 保存至少 1.5 小时或过夜（非常重要）；

11 、离心 15 分钟 / 400g 或 更高的转速，在 10 ～ 15 ℃ （非常重要）；分离全部上清液（应该是清亮的，非常重要），使其升到室温（ 20 ～ 24 度），然后用 RIDA C18 柱纯化（见 RIDA C18 柱纯化步骤）。

RIDA C18 柱纯化步骤：

所有试剂和样品处理必须在室温条件下（ 20-24 ℃）并严格控制过柱时的流速（非常关键）。

•  用 3ml 甲醇（ 100 ％）洗涤柱子，流速为 1 滴 / 每秒；

•  用 2ml 洗涤液洗涤柱子（ 50mM 磷酸二氢钾缓冲液 pH3.0 ）；

•  样品进柱（肝，肉，或组织的全部上清液）；

•  用 2ml 洗涤液洗涤柱子（ 50mM 磷酸二氢钾缓冲液 pH3.0 ）；

•  用正压去除残留的流体并且用空气或氮气吹 2 分钟干燥柱子；

•  用 1ml 甲醇（ 100 ％）洗脱样品，流速为 15 滴 / 分钟；

•  在 50 － 60 度并且在弱空气或氮气流下完全蒸发溶剂；

•  用 1ml 蒸馏水溶解干燥的残留物，取 20ul 进行分析。

注意：样品的保存

•  未处理的样品冷冻保存；

•  HCL 均质后的样品在 2 -8 ℃ 稳定3 天；

•  以磷酸二氢钾缓冲液提取后的样品（ RIDA C18 柱纯化之前）在 2-8 ℃稳定 2 天，使用前离心；

•  RIDA C18 柱纯化步骤 6 所获得的甲醇洗脱物可以冷冻保存数周，在 2 -8 ℃ 稳定2 周；

•  用蒸馏水溶解的干燥残留物（步骤 8 ）在 2-8 ℃稳定 1 周。